ПЦР: для чего нужен, как работает, разновидности

Что можно узнать с помощью ПЦР? 

В 1983 году американский биохимик Кэри Муллис столкнулся с проблемой обнаружения точечных мутаций в ДНК, включая те, которые вызывают тяжёлые генетические заболевания, например серповидноклеточную анемию. Он придумал использовать для этого полимеразную цепную реакцию. Благодаря применению специальных ферментов этот метод позволяет быстро и легко получить любое количество копий интересующего участка генома.

Сегодня большинству из нас аббревиатура ПЦР знакома из-за пандемии ковида. Полимеразную цепную реакцию применяют для диагностики инфекционных заболеваний. Кроме коронавируса, она выявляет ВИЧ, гепатиты, туберкулёз и множество других инфекций. Метод позволяет обнаружить вирус даже при минимальном его содержании в организме, что делает его незаменимым для ранней диагностики.

Для проведения анализа методом ПЦР достаточно соскоба буккального эпителия Фото: © Cryptographer / Shutterstock / FOTODOM

Ключевую роль ПЦР играет в генетике, давая возможность учёным выявлять наследственные заболевания вроде муковисцидоза или синдрома Дауна ещё до рождения ребёнка. Благодаря этой технологии можно определить мутации, связанные с риском развития рака и даже определить индивидуальную реакцию человека на лекарства.

«В своей работе я часто использую ПЦР с обратной транскрипцией, так как имею дело с экспрессирующимися баркодами. Мне важно, чтобы их было достаточно для детекции в образце. Для этого нужно делать ПЦР, причём именно этого баркодного участка», — рассказывает младший научный сотрудник Научного центра генетики и наук о жизни Университета «Сириус» Даниил Задорожный.

В онкологии ПЦР используют для обнаружения опухолевых клеток по их ДНК, что особенно важно для ранней диагностики и при наблюдении за пациентами после лечения. А в криминалистике метод позволяет идентифицировать человека по минимальным следам биологического материала: капле крови, волосу, частице кожи. Это основа современной ДНК-дактилоскопии, которая помогает раскрывать преступления, устанавливать родство и опознавать жертв катастроф.

Изображение: © Валентина Межецкая / «Сириус(Журнал»

Как работает ПЦР

Что нужно для проведения ПЦР:

• фрагмент ДНК, который необходимо скопировать;
• праймеры — фрагменты ДНК, которые служат своеобразной затравкой и обозначают, откуда должен начинаться синтез новой цепочки;
• ДНК-полимераза — фермент, запускающий процесс копирования;
• нуклеотиды, которые будут достраивать цепочку;
• буфер — раствор, включающий разнообразные ионы для регулирования необходимого уровня кислотности.

Перед началом амплификации происходит денатурация — разрушение нуклеотидной последовательности под действием температуры. Когда цепочки ДНК отсоединяются друг от друга, температуру понижают, и происходит отжиг праймера — его присоединение к одноцепочечной ДНК. 

Электрофорез помогает разделить молекулы по размеру — короткие и лёгкие фрагменты будут располагаться выше, чем длинные Фото: © Mohammed_Al_Ali / Shutterstock / FOTODOM

«Чтобы понять, „размножились“ ли нужные участки ДНК, миллионы её фрагментов загружают в агарозный гель и проводят процедуру электрофореза. Гель нагревают до +65 °С и помещают в специальную ёмкость, которая имеет углубления в форме гребня. Когда гель остывает и затвердевает, гребень извлекают. Ёмкость устанавливают в специальное устройство и заполняют жидким составом. Затем с помощью небольшой пипетки в углубления добавляют фрагменты ДНК из пробирок, в которые предварительно добавили краситель. Для определения размера фрагментов ДНК в одну из ячеек помещают специальный маркер, содержащий фрагменты известного размера. В процессе электрофореза в специальном геле под воздействием электрического тока молекулы ДНК перемещаются с разной скоростью в зависимости от их размера. Это позволяет учёным разложить фрагменты по длине и анализировать их», — объясняет Даниил Задорожный.

Праймеры подбираются так, чтобы они ограничивали нужный фрагмент и были комплементарны противоположным цепочкам ДНК. Праймер показывает нуклеотидам, в какое место им нужно присоединиться, после чего они вместе с ДНК-полимеразой начинают удлинять цепь. Этот процесс называется элонгацией, и он обычно проходит со скоростью 50–60 нуклеотидов в секунду. Удлинение цепи происходит в растворе-буфере, имитирующем среду клетки.

Виды ПЦР

ПЦР в реальном времени

Полимеразная цепная реакция в реальном времени помогает точно определить количество копий ДНК, которые образовались после одного цикла амплификации. Делают это с помощью нескольких нуклеотидов, подсвеченных с помощью флуоресцирующих изотопов. Их ещё называют ДНК-зондами.

Для одного из видов ПЦР используется ДНК-полимераза, выделенная из бактерий-экстремофилов вида Thermus thermophilus. Эти бактерии обитают в термальных источниках, расположенных на значительной глубине — до 2–5 километров. Вода в таких местах может прогреваться до 40 °С, а из-за высокого давления (300 атмосфер) она находится в особом состоянии, которое называется сверхкритическим.

Бактерия Thermus thermophilus была впервые обнаружена в горячем источнике на территории Японии Фото: © RYUSHI / Shutterstock / FOTODOM

ПЦР с обратной транскрипцией

У некоторых патогенов, например у вируса гепатита C, генетический материал представлен только в виде РНК. Это однонитевая цепочка нуклеотидов, которая не подходит для стандартной ПЦР. Метод с обратной транскрипцией позволяет превратить РНК в ДНК, добавив ей вторую цепочку с помощью специального фермента. После этого можно проводить полимеразную цепную реакцию. 

Цифровая ПЦР

Этот метод даёт возможность разделить образец на множество отдельных реакций, а затем анализировать каждую из них. Так можно точно измерить количество ДНК или РНК в образце, определив наличие или отсутствие искомого фрагмента в каждой реакционной капле.